Miskonsepsi merupakan salah satu permasalahan dalam pembelajaran biologi, karena proses pembelajaran biologi mempelajari banyak konsep – konsep ilmiah. Oleh karena itu, guru perlu berperan dalam mengidentifikasi terjadinya miskonsepsi siswa. Salah satu cara mengidentifikasi miskonsepsi siswa yaitu dengan menggunakan instrumen tes diagnostik four-tier. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengembangan instrumen tes diagnostik four-tier, serta untuk mengetahui validitas dan reliabilitas tes diagnostik four-tier yang dikembangkan. Jenis penelitian yang digunakan yaitu Research and Development (R&D). Metode yang digunakan adalah wawancara, tes, angket dan dokumentasi. Instrumen tes diagnostik four-tier yang dikembangkan berbentuk soal pilihan ganda yang terdiri atas kisi-kisi soal tes, petunjuk pengerjaan soal dan soal tes. Soal tes tersusun atas empat tingkatan yaitu tingkat pertama berupa soal dengan pilihan jawaban yang berkaitan dengan konsep biologi sel, tingkat kedua berisi tingkat keyakinan siswa memilih jawaban dengan metode CRI, tingkat ketiga disediakan alasan memilih jawaban soal, dan tingkat keempat berupa tingkat keyakinan siswa memilih alasan menjawab. Soal tes diagnostik yang dikembangkan tersusun dari 20 soal dengan lima submateri. Instrumen tes diagnostik four-tier yang dihasilkan sudah memenuhi aspek kevalidan yang dilakukan oleh ahli bidang materi dan evaluasi. Hasil analisis validasi tiap butir soal tes dinyatakan valid sehingga dapat diujikan kepada subjek penelitian. Hasil analisis reliabilitas instrumen tes diagnostik four-tier pada tahap uji coba skala kecil sebesar 0,88, pada tahap uji coba skala besar sebesar 0,90, dan pada tahap uji pemakaian sebesar 0,89 yang menunjukan dari ketiga tahap uji coba tersebut instrumen tes diagnostik four-tier yang dikembangkan tergolong memiliki tingkat keajegan yang sangat kuat dalam mengungkapkan miskonsepsi pada materi biologi sel, sehingga instrumen tes diagnostik four-tier yang dikembangkan layak untuk digunakan.