Tembakau kemloko (Nicotiana taabacum) merupakan salah satu komoditi penting bagi petani dan bagi negara, selain dapat digunakan sebagai bahan baku cerutu dan insektisida alami tembakau juga salah satu penunjang bea cukai terbesar bagi negara. Namun mengandalakan bibit dari metode konvensional menggunakan biji memerlukan waktu yang relatif lama dan hasilnya seringkali tidak homogen. Sehingga perlu usaha alternatif untuk mengatasi penyediaan bibit tembakau, misalnya dengan teknik kultur jaringan. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh kombinasi zat pengatur tumbuh (zpt) BAP dan NAA serta konsentrasi optimum yang yang diberikan oleh zpt terhadap induksi kalus tembakau kemloko (Nicotiana tabacum) secara in vitro. Desain penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan tidak menambahkan kombinasi zpt (Media A), menambahkan zpt BAP dan NAA dengan perbandingan 1:3 ppm (Media B), 2:2 ppm (Media C), 3:1 ppm (Media D) dengan pengulangan sebanyak 6 unit. analisis data pada penelitian ini menggunakan uji One Way ANOVA dan apabila nlai signifikasi P<0,05 maka dilakukan uji lanjutan yaitu dengan uji DMRT (Duncan Multiple Range Test). Hasil penelitian Menunjukan bahwa pengaruh kombinasi zpt BAP dan NAA dengan berbagai konsentrasi perlakuan tidak berpengaruh nyata terhadap bobot kalus, volume kalus, serta waktu awal inisiasi kalus. Konsentrasi optimum pada pertambahan bobot kalus dengan penambahan kombinasi zpt BAP dan NAA dengan perbandingan 3:1 (Media D), volume kalus dengan penambahan kombinasi zpt BAP dan NAA dengan perbandingan 2:2 (Media C), inisiasi kalus dengan penambahan kombinasi zpt BAP dan NAA dengan perbandingan 3:1 (Media D).