Sejumlah strain Escherichia coli bersifat patogen, seperti E. coli dari kelompok diarrheagenic E. coli (DEC) yang dapat menyebabkan infeksi diare. Pengobatan umum untuk infeksi ini biasanya dilakukan dengan pemberian antibiotik, namun penggunaan antibiotik sering kali menghadapi masalah resistensi. Salah satu penyebab resistensi ini adalah kemampuan bakteri membentuk biofilm sebagai mekanisme pertahanan diri terhadap lingkungan yang tidak menguntungkan, seperti stres lingkungan, kekurangan nutrisi, dan paparan antibiotik. Biofilm terdiri dari koloni bakteri yang terikat dan dikelilingi oleh matriks ekstraseluler yang dikenal sebagai extracellular polymeric substance (EPS), yang menghambat penetrasi antibiotik, sehingga membuat bakteri lebih sulit diobati. Masalah biofilm dapat diatasi dengan menggunakan agen antibakteri yang mampu mendegradasi biofilm melalui mekanisme yang berbeda dari antibiotik. Bakteriofag merupakan kandidat potensial karena memenuhi persyaratan tersebut. Bakteriofag menghasilkan enzim polisakarida lyase yang mampu mendegradasi senyawa extracellular polymeric substance (EPS) dalam biofilm. Penelitian ini mengisolasi bakteriofag dari sampel air limbah di Kota Semarang dan menguji kemampuannya sebagai agen antibiofilm E. coli ATCC 25922 serta mengkarakterisasi bakteriofag hasil isolasi melalui uji plaque assay, host range, one-step growth, dan analisis morfologi menggunakan TEM (transmission electron microscopy). Hasil penelitian menunjukkan bakteriofag S16 memiliki aktivitas tertinggi dalam menginhibisi pembentukan biofilm E. coli ATCC 25922 sebesar 93,32%, sedangkan bakteriofag S3 menunjukkan aktivitas eradikasi tertinggi sebesar 39,8%. Uji host range menunjukkan bakteriofag S3 memiliki spektrum lisis yang lebih luas dibandingkan isolat fag lainnya yang dapat menginfeksi E. coli ATCC 25922 dan tiga strain E. coli NBRC (12713, 13965, dan 13168). Analisis kurva one-step growth menunjukkan bakteriofag S3 memiliki periode laten lebih panjang (80 menit) dibandingkan S16 (50 menit), sedangkan ukuran burst size bakteriofag S16 (56,1 PFU/sel) lebih besar dibandingkan S3 (14 PFU/sel). Analisis morfologi menggunakan mikroskop transmisi elektron mengungkapkan bahwa bakteriofag S3 termasuk famili Siphoviridae, sedangkan S16 termasuk famili Myoviridae. Temuan ini menegaskan bahwa bakteriofag S16 dan S3 memiliki potensi yang signifikan sebagai agen antibiofilm terhadap E. coli ATCC 25922