Perkembangan teknologi dan informasi turut menghadirkan tantangan baru di dunia pendidikan yang perlu dikuasai siswa, salah satunya adalah keterampilan abad 21 atau dikenal dengan 4C, yaitu Critical Thinking, Team Building/Collaboration, Communication, dan Creativity and Innovation. Keterampilan berpikir kritis siswa dapat dipengaruhi berbagai faktor baik dari kognitif maupun afektif seperti kemandirian belajar dan self-efficacy. Penelitian ini memiliki tujuan untuk menjelaskan hubungan antar variabel keterampilan berpikir kritis, kemandirian belajar, dan self-efficacy siswa. Jenis penelitian ini adalah penelitian kuantitatif korelasional. Hasil penelitian menunjukkan bahwa keterampilan berpikir kritis, kemandirian belajar, dan self-efficacy saling berhubungan dibuktikan dengan nilai signifikansi p = 0,00<0,05. Keterampilan berpikir kritis dengan kemandirian belajar siswa memiliki hubungan positif yang sangat kuat dengan nilai korelasi sebesar 0,868. Self-efficacy dengan kemandirian belajar siswa memiliki hubungan positif yang kuat dengan nilai korelasi sebesar 0,720. Keterampilan berpikir kritis dengan self-efficacy siswa memiliki hubungan positif yang sangat kuat dengan nilai korelasi sebesar 0,798. Self-efficacy tidak dapat memediasi hubungan antara keterampilan berpikir kritis dengan kemandirian belajar siswa pada pembelajaran biologi yang ditunjukkan dengan nilai signifikansi p =0,367 > 0,05 dan nilai z sebesar 0,90 < 1,96