Gynura procumbens merupakan salah satu tanaman obat yang umumnya dibudidayakan secara luas dengan metode konvensional karena memiliki potensi senyawa metabolit sekunder flavonoid, saponin, dan terpenoid. Namun, untuk mempercepat regenerasi tanaman secara massal, metode konvensional tersebut membutuhkan waktu lama sehingga diperlukan metode kultur jaringan. Salah satu faktor penting yang memengaruhi keberhasilan regenerasi adalah pH media kultur. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pH asam dan menentukan rentang pH yang paling optimal terhadap tingkat keberhasilan regenerasi tunas eksplan batang Gynura procumbens secara in vitro. Perlakuan kultur dilakukan selama 4 minggu setelah kultur (4MSK) dengan menggunakan variasi rentang pH yang digunakan meliputi pH 2,7–2,8; 3,7–3,8; 4,7–4,8; dan pH kontrol 5,7–5,8. Analisis data dilakukan menggunakan uji Kruskal Wallis dan Uji lanjutan Post Hoc- Mann Whitney. Hasil analisis penelitian menunjukkan bahwa pH media berpengaruh nyata terhadap pertumbuhan eksplan. Media dengan pH sangat asam (2,7–3,8) menunjukkan tingkat keberhasilan regenerasi tunas yang rendah. Sebaliknya, media dengan pH mendekati kontrol (4,7–5,8) menunjukkan tingkat keberhasilan regenerasi tunas yang tinggi serta optimal untuk regenerasi tunas dari eksplan batang sambung nyawa (Gynura procumbens) secara in vitro.