Penelitian ini bertujuan untuk Mengetahui kelayakan instrument tes diagnostik two-tier test yang dikembangkan dalam identifikasi miskonsepsi pada materi ekologi dan untuk Mengetahui apakah instrumen tes diagnostik two-tier test yang dikembangkan dapat mengidentifikasi miskonsepsi siswa pada materi ekologi di MA Keterampilan Al-Irsyad Gajah Demak . Langkah – langkah penelitian atau proses pengembangan dalam penelitian ini mengikuti model pengembangan dari Sivasailam Thiagarajan, pengembangan 4-D tahap utama yaitu Define, Design, Develop, dan Disseminate. Tes diagnostik yang dikembangkan ialah tes diagnostik pilihan ganda dua tingkat yang terdiri dari soal pilihan ganda dan pilihan alasan dan berjumlah 40 butir soal. Persentase hasil penilaian validator ahli materi 81,25%, ahli evaluasi 84,37%, tanggapan guru 90,62 % serta tanggapan peserta didik 85,25 %, sehingga produk dinyatakan layak. Penelitian diuji cobakan kepada siswa dalam kelas kecil yang terdiri dari 8 siswa untuk mengetahui keterbacaan soal serta kelas besar sebanyak 31 siswa untuk menganalisis miskonsepsi pada konsep ekologi. Berdasarkan hasil penelitian diketahui bahwa terdapat 25% siswa paham konsep, 34% siswa miskonsepsi dan 41% siswa tidak paham konsep ekologi.