Sphagneticola trilobata ;L.;Pruski merupakan gulma yang mengandung minyak atsiri yang banyak tumbuh di Semarang dan Wonosobo. Sphagneticola trilobata ;L.;Pruski telah lama digunakan sebagai obat herbal. Produksi metabolit sekunder dipengaruhi oleh faktor lingkungan dan tempat tumbuh.Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan kandungan minyak atsiri pada daun Sphagneticola trilobata ;L.; Pruski di Semarang dan Wonosobo.Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari–Mei 2019, tempat pengambilan sampel di Semarang dan Wonosobo, untuk isolasi minyak atsiri di laboratorium UIN Walisongo dananalisis GC-MS di laboratorium terpadu UNDIP Semarang. Jenis penelitian ini adalah penelitian kualitatif.Metode penelitian iniyaitu pengamatan terhadap tempat tumbuh,morfologi Sphagneticola trilobata(L.) Pruski, isolasi minyak atsiri dengan maserasi dan pengujian kandungan minyak atsiri menggunakan analisisGC-MS, kemudian data dianalisis menggunakan analisisdeskriptif. Hasil penelitian ini yaitu kondisi tempat tumbuh di Semarang memiliki ketinggian 51 mdpl, dengan suhu 33,50C, kelembaban 80%, intensitas cahaya 985 dan pH tanah 7 sedangkan di Wonosobo memiliki ketinggian 877 mdpl, dengan suhu 28,30C, kelembaban 77%, intensitas cahaya 1840 dan pH tanah 6,9.Perbedaan tempat tumbuh (semarang (A) dan Wonosobo (B)) mempengaruhi ukuran morfologi Sphagneticola trilobata (L.) Pruski sampel A memiliki ukuran yang lebih besar daripada sampel B, tempat tumbuh juga mempengaruhi rendemen maserat maserat sampel A (8,1%) lebih tinggi daripada sampel B (5,1%) perbedaan tempat tumbuh juga mempengaruhi kandungan minyak atsiri terdapat 22 senyawa yang hanya pada sampel A dan 15 senyawa hanya pada sampel B dengan senyawa tertiggi kedua sampel sama yaitu Germacre-D, trans-Caryophyllen, cis-Verbenol dan Ethanol 2Butoxy yang masing-masing senyawa memiliki luas area yang berbeda. SenyawaGermacre-D(32,72%), trans-Caryophyllene(8,76%) pada sampel B lebih tinggi dari pada senyawa A dan senyawa cis-Verbenol(15,39%) dan Ethanol 2Butoxy (14,52%)lebih tinggi pada sampel A daripada sampel B.