Saat ini, dunia pendidikan sedang terdampak oleh perkembangan teknologi yang disebut masa era revolusi industri 4.0. Oleh karena itu, ada beberapa hal yang harus dikuasai adalah kompetensi dalam hidup setiap individu peserta didik salah satunya adalah Kemampuan Literasi Sains dan Higher Order Thinking Skills (HOTS). Selain kompetensi pengetahuan, siswa juga harus memiliki kepercayaan terhadap dirinya agar mampu mengerjakan dan melakukan tugasnya dengan baik, yakni Self-efficacy. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan kemampuan literasi sains dengan HOTS dan Self-efficacy sebagai variabel mediasi. Jenis penelitian ini adalah korelasional dengan metode survei. Teknik pengambilan sampel menggunakan Simple Random Sampling dengan sampel dari populasi siswa kelas XI SMA yang mendapatkan pembelajaran biologi. Teknik dan instrument pengumpulan data menggunakan tes berupa soal (kemampuan literasi sains dan HOTS) dan angket pernyataan (self-efficacy). Analisis data penelitian menggunakan deskripsi kuantitatif. Hasil penelitian ini adalah Terdapat hubungan antara kemampuan literasi sains dengan HOTS dengan persentase pengaruh 7,9%, terdapat hubungan antara self-efficacy dengan kemampuan literasi sains dengan persentase pengaruh 0,9%, terdapat hubungan antara self-efficacy dengan HOTS dengan persentase pengaruh 1,7%, dan tidak terdapat pengaruh tidak langsung dari self-efficacy terhadap hubungan kemampuan literasi sains dengan HOTS.