Tanaman jambu semarang (Syzygium samarangense (Blume) Merr. & L.M. Perry) merupakan tanaman buah tropis dari suku Myrtaceae yang dikelompokkan dalam buah non klimaterik. Salah satu daerah yang menjadi sentra jambu semarang adalah Kabupaten Demak. Belum ada yang melakukan analisis variasi genetik kultivar jambu semarang di Kabupaten Demak menggunakan DNA Barcoding Second Internal Transcribed Spacer (ITS-2). Tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi variasi genetik kultivar tanaman jambu semarang dari Kabupaten Demak pada wilayah DNA Barcode ITS-2, menentukan hasil amplikon ITS-2 dapat digunakan dalam analisis variasi genetik kultivar tanaman jambu semarang dari Kabupaten Demak, dan menganalisis hubungan kekerabatan pohon filogenetik kultivar jambu semarang dari Kabupaten Demak. Langkah-langkah pada penelitian ini terdiri dari pengambilan sampel daun, isolasi DNA, amplifikasi DNA, elektroforesis, sekuensing, analisis data sekuensing, dan rekonstruksi pohon filogenetik. Hasil menunjukkan bahwa terdapat variasi intraspesies yang rendah antar keempat sampel kultivar S. samarangense pada daerah ITS-2 dan terdapat variasi nukleotida yang tinggi antara spesies S. samarangense dengan spesies Syzygium lainnya pada daerah ITS-2. Pohon filogenetik menggambarkan bahwa sekuen sampel S. samarangense memisah sesuai perbedaan kultivar. Sampel S. samarangense kultivar Citra Botorejo berkerabat dekat dengan kultivar Citra Wonosari dan kultivar Citra Tempuran. S. samarangense kultivar Delima berada memisah pada cabang berbeda.