Jambu semarang (Syzygium samarangense (Blume) Merr. & L.M. Perry) merupakan salah satu komoditas pertanian yang terletak di Kabupaten Demak, Provinsi Jawa Tengah. Autentikasi dengan DNA Barcoding penting dilakukan untuk membuktikan keaslian spesies berbasis DNA karena sulit dibedakan secara morfologi, salah satunya menggunakan DNA Barcode psbA-trnH. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis karakteristik sekuen psbA-trnH intergenic spacer pada kultivar jambu semarang (S. samarangense) dari Kab. Demak, menganalisis hubungan kekerabatan antara kultivar jambu semarang (S. samarangense) dari Kab. Demak dengan data yang terdapat pada GenBank berdasarkan gen penyandi psbA-trnH, dan menentukan hasil DNA Barcoding sekuen DNA kloroplas psbA-trnH dapat digunakan dalam autentikasi kultivar jambu semarang (S. samarangense) dari Kab. Demak. Data diperoleh dari isolasi DNA sampel jambu semarang dari Ds. Boyolali, Kec. Gajah, Kab. Demak dengan mengikuti prosedur FavorPrepTM Plant Genomic DNA Extraction Mini Kit FAVORGEN. Siklus amplifikasi dilakukan sebanyak 35 kali dan kemudian dielektroforesis. Amplikon disekuensing di 1st BASE DNA Sequencing Services, Malaysia. Analisis data dilakukan menggunakan aplikasi BIOEDIT dan MEGA11. Proses alignment menggunakan program ClustalW dan rekronstuksi pohon filogenetik menggunakan metode neighbor-joining dengan algoritma Tamura-3 parameter dan nilai bootstrap replication 1000x. Hasil penelitian menunjukkan sekuen psbA-trnH pada jambu semarang (S. samarangense) kultivar Madu Thailand dan Madu Deli Hijau berturut-turut memiliki panjang 535 bp dan 492 bp. Komposisi Adenin (A) dan Timin (T) pada kedua kultivar lebih banyak dibandingkan komposisi Sitosin (C) dan Guanin (G). Berdasarkan analisis jarak genetik, hubungan kekerabatan antara jambu semarang (S. samarangse) kultivar Madu Thailand dan Madu Deli Hijau berkerabat sangat dekat atau merupakan spesies yang sama karena memiliki nilai matriks jarak genetik 0,000. DNA Barcode psbA-trnH tidak dapat mengautentikasi kultivar jambu semarang (S. samarangense) dari Kab. Demak. Kemampuan psbA-trnH untuk memisahkan kultivar jambu semarang dalam hal ini sangat rendah