Resistensi terhadap antibiotik semakin meningkat saat ini. Bakteri patogen telah menunjukkan resistensi terhadap berbagai jenis antibiotik saat ini. Sehingga, penting untuk menemukan sumber alami antibiotik baru yang memiliki potensi antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri asam laktat (BAL) dari usus ikan dan untuk mengetahui potensi kemampuan BAL untuk menghasilkan antibiotik terhadap E. coli dan S. aureus. sp. Isolasi BAL dilakukan dalam medium MRSA dan metode difusi cakram digunakan untuk mengetahui apakah isolat BAL mampu menghambat partumbuhan S. aureus dan Escherichia coli. Isolat yang didapatkan selanjutnya dikarakterisasi morfologi dan biokimianya. Berdasarkan hasil penelitian diperoleh lima isolat BAL yaitu B1, B2, B3, B4, dan B5. Isolat B1, B2, B3, B4, dan B5 mampu menghambat Escherichia coli yaitu sebesar 8.28 mm, 8.12 mm, 7.77 mm, 7.47 mm, dan 8.16 mm. Isolat BAL yang diperoleh juga dapat menghambat Staphylococcus aureus yaitu sebesar 8.14 mm, 7.38 mm, 5.25 mm, 7.98 mm, dan 8.35 mm. Berdasarkan hasil penelitian disimpulkan bahwa BAL yang didapat dari hasil isolasi usus ikan bawal dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen dengan kategori sedang.