Budidaya salak merupakan salah satu agribisnis hortikultura yang mulai mengalami penurunan akibat adanya alih fungsi lahan, adanya alih fungsi lahan akan membuat hilangnya habitat alami kultivar salak yang ada di Indonesia. Untuk mencegah kepunahan perlu dilakukan tindakan konservasi dilengkapi data molekuler agar perlindungan lebih optimal. Tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi variasi genetik Kultivar Salak Pondoh di Banjarnegara dan mengetahui variasi genetik DNA Barcoding ITS untuk membedakan kultivar Salak Pondoh di Banjarnegara. Tahapan dalam penelitian yaitu pengambilan sampel dan data parameter lingkungan, isolasi DNA, amplifikasi sekuen ITS, sekuensing, analisis jarak genetik menggunakan pairwise distance, dan pembuatan pohon filogenetik dengan UPGMA. Hasil penelitian menunjukkan variasi yang rendah pada kultivar Salak Pondoh pada wilayah ITS. Pada wilayah ITS1 terdapat tujuh variasi nukleotida (65, 108, 189, 190, 205, 214, 218), pada wilayah ini terdapat delesi pada dua nukleotida di semua sampel Kultivar Salak Pondoh. Pada wilayah ITS2 terdapat empat variasi nukleotida (483, 530, 532, 687), pada wilayah ini ditemukan insersi pada salah satu Kultivar Salak Pondoh. Variasi nukleotida yang ada pada kelima Kultivar Salak Pondoh pada wilayah ITS tergolong rendah dan belum dapat membedakan Kultivar Salak Pondoh secara spesifik. Berdasarkan analisis variasi genetik Salak Pondoh Nglumut dengan Salak Pondoh Manggala memiliki variasi nukleotida yang sama, Salak Pondoh Madu dengan Salak Pondoh Linting juga memiliki variasi nukleotida yang sama, sedangkan Kultivar Salak Pondoh Super memiliki variasi yang lebih banyak dibandingkan keempat sampel Salak Pondoh lainnya.