Indonesia merupakan salah satu negara dengan tingkat penangkapan hiu tertinggi di dunia. Penurunan populasi hiu sebesar 10% dalam sepuluh tahun akibat penangkapan berlebihan telah mengganggu keseimbangan trofik di ekosistem laut. Banyak hiu di Indonesia yang terancam punah dan belum diketahui spesies dan status konservasinya. Gen Cytochrome b merupakan salah satu gen di mitokondria yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi hewan karena telah terstandarisasi dan efisien untuk identifikasi ikan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efisiensi gen Cyt b dalam mengidentifikasi spesies hiu yang diperdagangkan di Tempat Pelelangan Ikan (TPI) Wedung, kabupaten Demak dan mengetahui variasi genetik hiu yang dibandingkan dengan data Genbank. Metode identifikasi spesies hiu dilakukan menggunakan metode morfologi dan molekuler dengan menganalisis gen Cyt b. Hasil sampling, diperoleh tiga ekor hiu dengan karakteristik morfologi yang sama dengan kode H1, H2, dan H3. Di antara ketiga sampel, hanya sampel H2 dan H3 yang dilanjutkan ke tahap analisis gen Cyt b, karena hasil ekstraksi DNA sampel H1 menunjukkan adanya kontaminan (smear). Hasil amplifikasi DNA menunjukkan hanya sampel H3 yang memenuhi kriteria untuk sekuensing, karena memiliki panjang yang sesuai target, yaitu 780 bp. Berdasarkan data elektroferogram dan BLAST menunjukkan sampel H3 teridentifikasi sebagai Rhizoprionodon terraenovae dengan percent identity sebesar 89%. Hasil ini didukung dengan data perbandingan morfologi dengan spesies Carcharhinus leucas dan Carcharhinus falciformis yang memiliki kemiripan dengan R. terraenovae. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa sampel H3 dapat diidentifikasi dengan menggunakan gen Cyt b dan memiliki variasi genetik yang tinggi dibandingkan dengan R. terraenovae dari GenBank.