Pembelajaran Biologi saat ini mendorong siswa untuk menguasai keterampilan abad ke-21, seperti keterampilan kolaborasi, yang dipengaruhi oleh literasi digital dan self-efficacy. Literasi digital mendukung kemampuan mengelola informasi secara efektif, sedangkan self-efficacy memengaruhi partisipasi aktif dalam kerja kelompok. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk menganalisis hubungan literasi digital dan self-efficacy dengan keterampilan kolaborasi pada pembelajaran Biologi. Penelitian ini menggunakan pendekatan kuantitatif berjenis korelasional melalui metode survei. Teknik pengambilan sampel menggunakan probability sampling berjenis proportionate stratified random sampling dengan sampel siswa kelas X dan XI yang menempuh mata pelajaran Biologi. Penelitian ini menemukan hubungan yang positif, signifikan, dan cukup kuat antara literasi digital dengan keterampilan kolaborasi pada pembelajaran Biologi (r = 0,511), terdapat hubungan yang positif, signifikan dan lemah antara self-efficacy dengan keterampilan kolaborasi pada pembelajaran Biologi (r = 0,334), serta terdapat hubungan yang positif, signifikan, dan cukup kuat antara literasi digital dan self-efficacy secara bersama-sama dengan keterampilan kolaborasi pada pembelajaran Biologi (R = 0,522).