Kebutuhan akan alternatif pewarna alami yang ramah lingkungan semakin mendesak, mengingat penggunaan pewarna sintetis dapat mencemari lingkungan dan memiliki efek karsinogenik. Oleh karena itu, pemanfaatan ekstrak kulit buah naga merah (Selenicereus monacanthus L) sebagai pewarna alami untuk preparat mitosis akar bawang (Allium cepa L) menjadi solusi alternatif yang menjanjikan. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis kombinasi ekstrak kulit buah naga dan konsentrasi mordan yang paling optimal dalam pewarnaan preparat mitosis akar bawang, menganalisis validitas, respon peserta didik dan desain bahan ajar biologi (buku suplemen) yang dikembangkan dari pemanfaatan ekstrak tersebut. Metode yang digunakan dalam penelitian ini meliputi ekstraksi kulit buah naga dan pengujian variasi konsentrasi mordan, dengan analisis kekontrasan dan kejelasan preparat sebagai parameter utama. Penelitian ini juga melibatkan pengembangan bahan ajar berupa buku suplemen yang divalidasi oleh ahli materi dan ahli media, serta diuji coba kepada peserta didik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kombinasi pelarut asam asetat 70% dan etanol 96% dengan mordan 10% pada rasio 5:1 menghasilkan kejelasan dan kontras yang optimal pada kromosom, mencapai 95,83%, setara dengan pewarna sintetis. Buku suplemen yang dikembangkan dari hasil penelitian ini dinyatakan valid dengan nilai 91% dari ahli materi dan 93% dari ahli media, serta mendapat respon positif dari peserta didik dengan rata-rata di atas 90% untuk aspek materi, tampilan, keterbacaan, dan bahasa. Kesimpulannya, ekstrak kulit buah naga dapat menjadi alternatif efektif dan ekonomis untuk pewarnaan preparat mitosis, serta berkontribusi pada pengembangan bahan ajar biologi yang inovatif dan relevan.