Kitolod (Isotoma longiflora L) merupakan salah satu tanaman herbal yang mengandung senyawa antibakteri. Senyawa metabolit yang terkandung antara lain alkaloid, flavonoid, tanin dan saponin diketahui memiliki potensi sebagai antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak metanol daun kitolod (Isotoma longiflora L) terhadap bakteri Lactobacillus acidophilus. Lactobacillus acidophilus yang merupakan bakteri penyebab karies gigi. Metode pada penelitian ini yaitu uji daya hambat menggunakan metode kertas cakram dan penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dengan metode dilusi cair menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak metanol kitolod (Isotoma longiflora L) memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri Lactobacillus acidophilus pada konsentrasi 25% tergolong lemah pada uji daya hambat karena terbentuk zona bening 3,495  1,348 mm di sekitar kertas cakram dan nilai konsentrasi hambat minimum pada konsentrasi 0,78% telah menghambat pertumbuhan bakteri.