Materi biologi yang dipandang sebagai materi sulit mengakibatkan kesulitan belajar, sehingga peserta didik dapat mengalami miskonsepsi. Tes diagnostik merupakan pilihan cara untuk mengetahui kesulitan bahkan miskonsepsi yang dialami peserta didik. Tes diagnostik yang dikembangkan berupa instrumen tes diagnostik five-tier berformat pilihan ganda. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan dan menguji kelayakan instrumen tes diagnostik five-tier serta mendeskripsikan profil miskonsepsi dan penyebabnya pada materi sistem koordinasi dan sistem imun. Jenis penelitian berupa Research and Development (R&D), dengan model 4D (Define, Design, Develop, & Disseminate). Penelitian ini mendapatkan hasil berupa instrumen tes diagnostik five-tier yang dikembangkan pada materi sistem koordinasi dan sistem imun. Butir-butir soal tes diagnostik five-tier yang dinyatakan valid oleh validator ahli berjumlah 24 pada masing-masing materi dan dapat diuji cobakan secara terbatas. Hasil uji coba terbatas dinyatakan bahwa terdapat 18 butir soal pada materi sistem koordinasi dan 20 butir soal pada materi sistem imun yang layak digunakan untuk uji selanjutnya. Hasil angket respon peserta didik menyatakan bahwa kedua instrumen yang dikembangkan berkategori baik, namun alokasi waktu yang digunakan perlu dikaji ulang. Penelitian ini menunjukkan bahwa profil miskonsepsi peserta didik berada pada kategori sedang. Miskonsepsi tersebut disebabkan oleh pemikiran pribadi peserta didik (misconception from personal thinking). Miskonsepsi pada materi sistem koordinasi tertinggi ditemukan pada indikator struktur dan fungsi sel saraf, fungsi jenis-jenis kelenjar endokrin, dan fungsi bagian mata berdasarkan gambar. Adapun pada materi sistem imun ditemukan pada indikator organ limfoid dalam sistem imun dan perbedaan pertahanan nonspesifik dan spesifik.